产品目录

本试剂盒适用于从各种植物样品中提取总外泌体。不需要超速离心，仅需通过简单的常规离心即可从样本中获取大量结构完整的外泌体，具有快速简单，提取效率高的特点，可节省更多的实验时间和样本。提取的外泌体可根据实验目的用于后续的各种功能研究、蛋白分析及RNA分析等下游应用实验。

• 使用方便，无需超速离心，省时省力。
  
• 纯度高，富集量大，应用范围广。
  
• 获取的Exosome结构和功能完整。
  
• 稳定性好，便于运输，便于保存。

外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性小囊泡，直径约为30～150nm，天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等各种体液中，研究发现，Exosome内含有与细胞来源相关的蛋白质、mRNA和microRNA，并且exosome能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能。外泌体囊泡已经成为细胞间通讯的重要介质，参与原核生物和高等真核生物细胞之间的生物信号传递，以调节不同范围的生物过程。未修饰和工程化的外泌体囊泡可能在大分子药物递送中具有应用价值。

植物来源的外泌体状纳米颗粒(PENs)逐渐成为研究领域的热点。一方面PENs是自然产生的，携带来自其母细胞的无害成分，并且其中一些已被证明具有治疗作用；另一方面，更多研究者们也聚焦其作为哺乳动物细胞来源外泌体(MDEs)替代品，以规避MEDs技术的局限性，尤其是在靶向递送系统方面。PENs的生理、化学和生物学特性决定了其高稳定性，可以在体内的某些组织中积累并长期在外周血中循环，结合其低毒性、低免疫原性、高细胞摄取率的等优点，因此在疾病治疗以及作为纳米载体的应用开发中具有巨大的潜力。

PENs和MDEs之间有许多相似之处，但两者仍存在较多差异。MDEs的脂质双层主要由胆固醇、糖苷脂、神经酰胺和磷脂酰丝氨酸组成，它们具有稳定性和独特的刚度。相比之
下，PENs的外泌体膜富含磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、糖基二酰基甘油(DGDG)和单半乳糖基二酰基甘油(MGDG)，这些独特之处使其具有细胞调节活性，并可以在不同物种间的交流发挥更大作用。

• 仪器准备：离心机、移液器、冰箱、冰盒
  
• 试剂准备：PBS缓冲液、纯水
  
• 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套

• 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。?试剂拆封后请尽快使用完。
  
• 不同样本的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的样本。
  
• 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

• 清洗外泌体纯化离心管C(大)和D(小)
  
  • 用缓冲液或纯水进行预清洗。
    
  • 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用前移除并稍微离心甩干。
    
    • 可以在外泌体提取步骤中需要使用前再清洗。
      
    • 重复使用时要仔细检查管壁上有没有裂纹。
• 样品处理
  
  • 收集500mg～1g新鲜的待提取植物样品，根据不同样品进行剥皮、彻底清洗等处理，置2～8℃保存。
    
  • 在样品中加入1～2mL外泌体提取液A，然后用匀浆机/匀浆器充分匀浆。
    
  • 将匀浆液1000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
    
  • 小心将上清移入另一干净离心管中。
    
  • 将样品在4℃条件下，3000×g离心30分钟。弃沉淀，收集上清。
    
  • 小心将上清移入另一干净离心管中。
    
  • 将样品在4℃条件下，12000×g离心60分钟。弃沉淀，收集上清。
    
  • 小心将上清移入另一干净离心管中。即得到待提取植物匀浆液(0)。
• 外泌体粗提
  
  • 将待提取植物匀浆液(0)上清吸入离心管E中，套上液体收集管，在4℃，10000×g条件下离心5～10分钟。
    
  • 向内管中加入2mL的外泌体粗提液(I)样本，并盖上盖子。
    
  • 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。
    
  • 以4000～10000×g离心约10～30分钟。离心至大约剩余50μL～100μL液体。
    
  • 在50～100μL残余液体中加入1mL外泌体提取液B。
    
  • 以4000～10000×g离心约10～30分钟。离心至大约剩余50μL～100μL液体。
    
  • 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
    
  • 为了回收纯化后的外泌体，用200μL移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的50～100μL纯化外泌体悬液(II)。
    
  • 套上外泌体纯化离心管D(小)的液体收集管，将纯化外泌体悬液(II)吸入外泌体纯化离心管D(小)的离心管(内管)中，加入50μL外泌体提取液B，在4℃，11000～13000×g条件下离心10～15分钟。
    
  • 吸取外泌体纯化离心管D(小)的收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。
    
  • 用纯水或缓冲液洗涤两种大小的内管和收集管，继续纯化下一个样品。
    
    如果使用过的离心管需要长期保存，可以按下列方法清洗和保存离心管内管。
• 外泌体纯化离心管C(大)清洗和保存
  
  • 使用后用水冲洗干净。
    
  • 内管加入超纯水4mL，4000×g离心5分钟。
    
  • 吸净内管中的水，加入4mL 0.1M NaOH，4000×g离心20分钟。
    
  • 用0.1M NaOH浸泡24小时。
    
  • 用水冲洗干净。
    
  • 用无菌水浸泡2～8℃保存。
    
  • 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

• 准备做植物外泌体研究，初始样品量需要准备多少？
  不同样本外泌体含量差异较大，根据文献选择起始样本量。有条件的情况下尽可能使用多一点样本量。
  
• 如何鉴定提取的外泌体？
  通常使用透射电镜检测(形态)、粒径检测(大小)、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。
  
• 进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？
  没有，该检测属于定性检测。
  
• 蛋白浓度低？
  很多样本外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大植物样本的上样量。
  处理部分外泌体样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。
  
• 外泌体纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
  不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约20μL。
  
• 可以重复使用过滤管么？
  可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。